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                                一篇看懂液相色譜柱的分類、選擇及維護!

                                發布時間:2021-08-02      點擊次數:559
                                  一篇看懂液相色譜柱的分類、選擇及維護!
                                 
                                  1.硅膠基質
                                 
                                  1.1反相色譜柱:反相色譜填料常是以硅膠為基礎,表面鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強,通常為水,緩沖液與甲醇,已腈等混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強組合最先被沖出,而極性弱的組份會在色譜柱上有更強的保留。常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。
                                 
                                  1.2正相色譜:正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica),以及其他具有極性官能團,如胺基團(NH2,APS)和氰基團(CN,CPS)的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其他團的極性較強,因此,分離的次序是依據樣品中的各組份的極性大小,即極性強弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(MethyleneChloride)等。
                                 
                                  1.3離子交換色譜柱:以磺化交聯強陰/陽離子鍵合硅膠色譜柱,常用規格:強陰離子色譜柱(SAX),強陽離子交換色譜柱(SCX)
                                 
                                  2.聚合物基質:聚合物調料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等,其主要優點是在PH值為1~14均可使用。相對與硅膠基質的C18填料,這類填料具有更強的疏水性;大孔的聚合物填料對蛋白質等樣品的分離非常有效。現在的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質填料,色譜柱柱效較低。
                                 
                                  所有聚合物基質在流動相發生變化時都會出現膨脹或收縮。用于HPLC的高交聯度聚合物填料,其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質中,因為小分子在聚合物基質中的傳質比在陶瓷性基質中慢,所以造成小分子在這種基質中柱效低。對于大分子像蛋白質或合成的高聚物,聚合物基質的效能比得上陶瓷性基質。因此,聚合物基質廣泛用于分離大分子物質。
                                 
                                  3.其他無機填料:其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化。
                                 
                                  由于其特殊的性質,一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質烷基鍵合相,石墨化碳的表面即是保留的基礎,不再需其它的表面改性,該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強,石墨化碳可用于分離某些幾何導構體,又由于HPLC流動相中不會被溶解,這類柱可在任何PH與溫度下使用。
                                 
                                  氧化鋁也可用于HPLC,氧化鋁微粒剛性強,可制成穩定的色譜柱柱床,其優點是可在PH高達12的流動相中使用。
                                 
                                  但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強,應用范圍受到一定的限制,所以未能廣泛應用,新型氧化鋯填料也可用于HPLC,商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱,應用PH范圍1~14,溫度可達100℃。由于氧化鋯填料幾年才開始研究,加之面臨的實驗難度,其重要用途與優勢尚在進行中。
                                 
                                  二.色譜柱的選擇
                                 
                                  液相色譜儀基質的選擇大致遵循以下法則,硅膠基質的填料被用于大部分的HPLC分析,尤其是小分子量的被分析物,聚合物填料用于大分子量的被分析物質,主要用來制成分子排阻和離子交換柱。
                                 
                                  色譜柱在使用前,最好進行柱的性能測試,并將結果保存起來,作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件),只有這樣,測得的結果才有可比性。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。
                                 
                                  三.色譜柱的維護
                                 
                                  1.色譜柱的平衡
                                 
                                  反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請一定確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶。每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱,您就會在處理問題方面獲得最大的"補償",
                                 
                                  2.色譜柱的再生,長期使用的色譜柱,往往柱效會下降(柱子的理論塔板數減低)。可以對色譜柱進行再生,在有條件的實驗室應使用一個廉價的泵進行柱子的再生。
                                 
                                  建議用來沖洗柱子的溶劑體積
                                 
                                  3.色譜柱的維護
                                 
                                  a.使用預柱保護分析柱(硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度)
                                 
                                  b.大多數反相色譜柱的pH穩定范圍是2-7.5,盡量不超過該色譜柱的pH范圍
                                 
                                  c.避免流動相組成及極性的劇烈變化
                                 
                                  d.流動相使用前必須經脫氣和過濾處理
                                 
                                  e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相,應在實驗完畢柱子沖洗干凈,并保存于甲醇或乙腈中
                                 
                                  f.氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,故使用時要注意,柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑,以避免腐蝕。
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